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细胞计数实验

点击次数:160  发布时间:2020-05-25
 
 
实验用品
 
0.4%台盼蓝溶液、无水乙醇或95%乙醇溶液、脱脂棉
普通显微镜、试管、吸管、毛细吸管、细胞计数板、绸布。
 
实验原理
 
在细胞培养工作中,常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活,确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度,如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别,冻存细胞复苏后的活力检测等。细胞悬液制备后,常用活体染料台盼蓝对细胞进行染色,进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜,故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高,可使染料进入细胞内而使细胞着色(蓝色)。细胞计数一般用血细胞计数板,按白细胞计数方法进行计数,便于确定细胞的生活状况。
 
实验内容与方法
 
(一)制备动物细胞悬液
 
将动物细胞用生物盐水制备成适当浓度的细胞悬液备用。
 
(二)细胞计数
 
1. 计数板处理
用无水乙醇或95%乙醇溶液擦拭计数板后,用绸布擦净,另擦净盖玻片一张,把盖片覆在计数板上面。
 
2. 染色
用滴管吸取0.4%台盼蓝染液,按1∶1比例加入细胞悬液中。从计数板边缘缓缓滴入,使之充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡,否则要重做。稍候片刻,将计数板放在低倍镜下(10×10倍)观察计数。
 
3. 计数方法
按图计算计数板的四角大方格(每个大方格又分16个小方格)内的细胞数。计数时,只计数完整的细胞,若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中,如果有细胞位于线上,一般计下线细胞不计上线细胞,计左线细胞不计右线细胞。二次重复计数误差不应超过±5%(图7-1)。镜下观察,凡折光性强而不着色者为活细胞,染上蓝色者为死细胞。
 
4. 计数的换算
计完数后,需换算出每ml悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为0.01 cm2,高为0.01 cm,这样它的体积为0.0001 cm3,即0.1 mm3。由于1 ml=1000 mm3,所以每一大方格内细胞数×10 000=细胞数/ml,故可按下式计算:
细胞悬液细胞数/ml=4个大格细胞总数/4×10 000
如计数前已稀释,可再乘稀释倍数。
计数细胞后,计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。
 
注意事项:
向计数板中滴细胞悬液时要干净利落,加量要适当,过多易使盖片漂移,或淹过盖片则失败,需重做,过少易出现气泡;不理想时,应重做;
镜下计数时,若方格中细胞分布明显不均,说明细胞悬液混合不均匀,需重新将细胞悬液进行混合,再重新计数。
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