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二代测序 QC 全流程,这可能适合你的QC方案!!!

点击次数:430  发布时间:2020-12-24

 

     在过去的数年间,二代测序( NGS )在几乎所有的遗传研究和诊断领域都发展为了一个强大的工具。而任何 NGS 实验成功的关键是初始 RNA 和 DNA 样本以及它们所生成的文库的质量控制(QC)。

二代测序(NGS)的建库流程是很长很复杂的,建库的每一步都建立在前一步的基础上,因而质量控制(QC)显得尤为重要。无论您的初始样本类型是什么,在整个实验流程中,确保靶标的完整性、大小和集中程度是构建高质量文库,进而获得准确、可重复的结果的关键。为了帮助您更好地确定实验流程,安捷伦汇总了各类初始样本的各种建库流程。

理想的 NGS 质 控步骤应易于操作、经济,并且对于浓度非常低的样品也能提供快速且无争议的结果。本质控方法是运用琼脂糖电泳法来判断样本的大小与完整性,该方 法成本低,但有种种局限性,具体就不在此赘述。确保样品“满足目标用途”的另一种方法是应用自动化的电泳分离,并进行荧光检测和自动数据分析。

 

 

 

 

测序过程中的关键 QC 步骤

  • Fragmentation

片段化是将样本剪切成更小的片段的过程。可以通过酶切或超声的方法来实现。QC 是这里的一个重要步骤,以确保片段化的条件是合适的。

  • Ligate adaptors

接头是已知的寡核苷酸序列,用于连接到未知的目标测序片段,提供测序引物结合区和样本识别码。接头连接后的 QC 可以确保接头成功连接到 DNA。

  • Size selection

片段筛选的目的是去掉多余的引物和接头序列,获得需要的目标序列。QC 在这一步是至关重要的,可以确保后留下的是目标大小和足够浓度的文库。

  • Normalize/pool

在文库制备结束时,必须对样本进行量化,以确定要加载到测序仪上的文库量。如果需要多个文库混合上机测序,QC 可以帮助提供稀释指导,确保加载到测序仪上的文库是均匀的,有利于提高数据的均一性。

 

 

 

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