ProteanFect CRISPR Ultra 转染试剂盒产品详解 产品简介

ProteanFect CRISPR Ultra 转染试剂盒产品详解

产品简介

ProteanFect CRISPR Ultra 转染试剂盒是ProteanFect系列中专为难转细胞系基因编辑而设计的创新产品。该试剂盒基于自组装蛋白纳米颗粒技术，作为一种非病毒、非电转、非脂质体的转染试剂，能够高效且安全地将基因编辑工具RNP（包含Cas9蛋白和guide RNA）递送至细胞内，从而实现高效的基因编辑。

储存与成分

运输与储存‌：ProteanFect CRISPR Ultra 转染试剂盒采用干冰运输，收到后应立即存放于-80℃直至使用。

试剂盒规格‌：依据Reagent B的体积设定。

试剂盒组分及存储‌：

Reagent A（PT07）：使用后保存于2-8℃。

Reagent B（PT07）：保存于-20℃，避免反复冻融。

Cas9 protein（1 µg/µL）：保存于-80℃，避免反复冻融。

EGFP mRNA（1 µg/µL）：阳性对照，保存于-80℃，避免反复冻融。

Human TRAC-sgRNA（1 µg/µL）：阳性对照，靶向序列为TGTGCTAGACATGAGGTCTA，保存于-80℃，避免反复冻融。

实验前准备

待转染细胞‌：细胞必须处于良好的生长状态，活率＞90%。

推荐培养基‌：Opti-MEM培养基（或无血清的RPMI 1640培养基/无血清DMEM培养基），提前预热至室温。

转染试剂‌：室温自然解冻，颠倒或涡旋至溶液均一后使用。

其他材料‌：完·全培养基、无菌EP管、所需转染的核酸样品。

操作步骤（以96孔板体系为例）

配置ProteanFect转染体系‌：

在40 µL Reagent A（PT07）中加入0.8 µg（约5 pmol）Cas9 protein和0.3 µg（约10 pmol）sgRNA，充分混匀。

加入1.4 µL Reagent B（PT07），移液枪上下吹打20-30次或涡旋10秒，使其充分混匀。配置完成后置于冰上保存；如需在室温下保存，须在30分钟内使用完毕。

细胞处理‌：

悬浮细胞‌：取待转染细胞，300g离心5分钟，弃去上清后以Opti-MEM重悬细胞沉淀，再次离心，最终用Opti-MEM重悬并调整细胞浓度至5×10⁶ - 1×10⁷ cells/mL备用。

贴壁细胞‌：转染前汇合率保持在50%-80%，弃去培养基后，用Opti-MEM轻柔清洗细胞两次，并加入20 µL Opti-MEM备用。

细胞转染‌：

将配置好的ProteanFect转染体系与20 µL细胞悬液混合后，在离心管中孵育（或直接加入贴壁细胞中）。

37℃培养箱孵育45-60分钟（孵育时间可根据不同细胞类型进行适当调整）。

加入约5倍转染体系体积的完·全培养基，300g离心5分钟，弃去上清（贴壁细胞可直接弃去混合液并补加培养基）。

细胞培养与观察‌：

加入适量完·全培养基，进行细胞培养，72小时后可对靶点进行编辑效率分析。

转染不同规格孔板的使用含量

以下提供了不同规格孔板转染时的各组分使用含量：

孔板类型Reagent A（PT07）Cas9 protein/sgRNAReagent B（PT07）推荐每孔细胞数（Opti-MEM）

96孔40 µL0.8 µg/0.3 µg1.4 µL1×10^5~2×10^5（20 µL）

48孔80 µL1.6 µg/0.6 µg2.8 µL2×10^5~4×10^5（40 µL）

24孔200 µL4 µg/1.5 µg7 µL4×10^5~1×10^6（100 µL）

12孔600 µL7.5 µg/4.5 µg21 µL1×10^6~3×10^6（300 µL）

6孔800 µL16 µg/6 µg28 µL2×10^6~4×10^6（400 µL）

数据分享

使用ProteanFect CRISPR Ultra转染试剂盒转染Jurkat细胞，并使用试剂盒中的Human TRAC-sgRNA阳性对照敲除TRAC基因。转染72小时后，收集细胞DNA水平检测基因敲除效率。结果显示，阳性对照组中靶点基因被编辑的比例约为63.4%，平均编辑效率约为63.9%。

常见问题解答

如何提升转染效率‌？

根据细胞类型和培养条件优化转染条件。

适当延长转染时间（通常细胞系不超过2小时）。

适当增加转染体系至初始的1.5-2.5倍。

细胞系转染前处理‌？

使用活性超过90%的细胞。

不建议使用传代次数超过15次的细胞。

新复苏的细胞需传代2-3次后使用。

关于EGFP mRNA阳性对照的使用‌？

首·次尝试时，建议设置阳性对照组（EGFP mRNA），以检测实验操作和试剂的有效性。使用96孔板的细胞量即可，节省细胞和试剂。

RNP的投入量如何确定‌？

Cas9蛋白和sgRNA的摩尔比推荐在1：1-1：2.5之间。

以96孔细胞量的转染体系为例，Cas9蛋白的投入量在0.8 µg-1.6 µg。

转染后的细胞处理‌？

转染后，细胞状态可能与未处理组略有差异。但使用ProteanFect试剂进行转染时，对细胞活力的损伤较小。通常在转染后第二天，细胞状态会基本恢复。

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